OBTENCIO DE MOSTRES

Els teixits es poden obtenir de diferents formes:

a) Biòpsia (bios = vida; opsis = visió): Tallar la mostra en petites porcions i fixar-la per

immersió en el líquid fixador.

b) Autopsia

En en nostre cas, vam dissecionar un conill. Vegeu les imatges:

 

FIXACIÓ

En aquest pas, es col·loca en una substància fixadora per a:

• Preservació de la morfologia cel·lular i tissular

• Inactivar els sistemes enzimàtics cel·lulars i tissulars  (aturada de L’AUTÒLISIS: destrucció d’un òrgan o teixit  per efecte dels enzims proteolítics dels propis teixits)

• Augmentar la consistència del teixit (facilita el tall)

• Efecte MORDENT: millora la captació de substàncies colorants

• Acció antisèptica (no destrueix els prions)

Cal tenir en compte els diferents mecanismes d’acció (formació d’enllaços entre grups reactius, deshidratació,  precipitació de proteïnes....). S'utilitza:

– Formol al 10% (formaldehid): microscopia òptica, es un dels fixadors mes utilitzats.

– Para-formaldehid / glutaraldehid: microscopia electrònica

–Fixació per IMMERSIÓ (o difusió) o per PERFUSIÓ

TALLAT

Tallat en porcions petites d’un gruix màxim de 3 mm i una superfície màxima de 2x1.5 cm.

Introducció de les porcions de teixit en una càpsula de plàstic (cassettes) i es tapen amb unes reixes (metàl·liques o de plàstic)

⇒ Fonamental ORIENTAR la mostra

PROCESSADOR DE TEIXITS

Objectiu del processador de teixits

Omplir els espais dels teixits intracel·lulars i extracel·lulars de parafina per a donar-li una consistència per a la posterior microtomia.

Components del procesador

Esta composat per 10 recipients de cristall i dos de metall amb resistencies. Els recipients de cristall es reparteixen de la seguent forma: 2 per a etanol 80º, 2 per a etanol de 96º, 3 per a etanol de 100º i 3 per a xilol. En els de metall s’introdueix parafina que es desfà per acció térmica i penetra en els teixits atorgant-los una consistència. A mes a mes, les mostres estan introduides en un cistell metalic que es va movent automàticament.

Procediment tècnic

Per a començar la inclusió, s’ha de programar el procesador, el qual es fa de la seguent forma: als dos primers recipients se’ls dona un temps de dos hores, als 8 seguents un temps d’una hora i mitja i als dos de parafina, que són els ultims, se’ls dona un temps de dues hores. Tot això, ja ve determinat pel programa.

Una volta fet això, s’introdueix el cistell amb les mostres en el primer recipient i quan acaba en este, es passa automàticament al segon i així successivament fins acabar el programa.

Una volta extretes les mostres del procesador de teixits, es posen en la estació de parafina per a recobrir-les per fora amb aquest material.

ESTACIO DE PARAFINA

Objectiu:

Aconseguir un bloc consistent en el que estigui inclós el teixit processat prèviament per a poder obtener talls fins amb el microtom.

Components de la estacio de parafina:

Esta composta d’un dispensador de parafina, un recipient amb parafina liquida per a depositar les mostres que no es van recobrir amb parafina en el moment, una placa freda per a que s’endureixin els blocs ja recoberts i un aparell per als recipients de plastic o metall en els que es posen els teixits.

Procediment tècnic:

S’agafa un cassette del recipient amb parafina liquida, s’obre i es posa el teixit en un recipient de metall (que estan calentes) i a sobre es col·loca la part de sota del cassette. Se li afegeix parafina per sobre (apretant amb la palanca amb unes pinzes per a que surti la parafina del dispensador), es deixa gelar uns segons i se li torna a afegir parafina. Es posa en la placa freda per a endurir el bloc de parafina. Una volta refredat, es guarda en el refrigerador fins al moment en que s’han de realizar amb el microtom.

MICROTOM
Eosina (colorant ÀCID) ⇒ reacciona amb els components intra i extracel·lulars de caràcter BÀSIC
(100º ⇒ 96º ⇒ 70º ⇒ 50º ⇒ aigua) 
Objectiu:

Aconseguir talls lo suficientment fins (4-6) del teixit inclos (en parafina), per a la seua posterior visualització al microscopi.

Components i material necessari.

Es composa d’un porta- blocs amb orientació regulable que avança sobre una ganiveta discontinuament, un porta ganiveta amb un sistema per regular la inclinació de la ganiveta, una palanca de tornillo macromètric que apropa i allunya el porta- blocs a la ganiveta, un tornillo micromètric que mou el porta- blocs de dalt a baix fent-li incidir sobre la ganiveta i un tornillo on posa el gruix dels talls.

El material que es necesita es: ganiveta per a microtom, bany d’aigua relativament calenta per a estirar els talls ja que es pleguen, una agulla histológica per  a recollir els talls realitzats i posar-los al bany per que s’estirin, un raspall petit per a limpiar el microtom, portaobjectes per a recollir els talls elegits del bany i un llapis de grafit per a nombrar els portaobjectes.

Procediment tècnic

Es procedeix a col·locar tot el material necessari en la taula del microtom per a no perdre el temps, s’agafa un bloc de parafina del refrigerador i  s’eliminen les sobres de parafina en la seua periferia, es col·loca en el porta-blocs, s’orienta el porta blocs i la ganiveta, es posa un gruix elevat, per tal de debastaar fins aconseguir un tall uniforme en el que apareixi tota la superficie del teixit, es canvia el gruix a 4 o 6, per a obtener talls fins que es recolliran amb l’agulla histológica i es depositen en el bany. Una volta estirats, es recolleixen, amb portaobjectes nombrats per al seu secat en la estufa.

Es limpia el microtom i es recolleix tot el material.

SECAT

Objectiu: 

Eliminar l’aigua dels teixits per evaporació aixi com la parafina sobrant que es pega al portaobjectes al derritir-se i aixi s’evit el desprendiment dels talls.

Material necessari: estufa de laboratori

Procediement tècnic: col·locar l’estufa dels talls abans de realizar-los amb el microtom a 37º.

TINCIÓ

• Permet evidenciar i diferenciar les estructures cel·lulars i tissulars

• Tinció rutinària d’HEMATOXIL·LINA i EOSINA

Hematoxil·lina (colorant BÀSIC) ⇒ reacciona amb els components intracel·lulars intercel·lulars de caràcter ÀCID 

Ambdós són colorants hidrofílics

Consisteix en vàries etapes: 

• Desparafinar

• Hidratar en bateria decreixent d’alcohols

• Tinció

• Deshidratar en bateria creixent d’alcohols

• Aclariment en solvents orgànics (xilè)

MUNTATGE DE LA PREPARACIÓ HISTOLÒGICA

Amb DPX, entre porta i cubreobjectes, ja que permet conservar la preparació histològica per molt temps.